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微流控芯片在牙周領(lǐng)域中的應(yīng)用及展望
牙周病是一種由微生物引起的慢性炎癥性疾病，不僅可能導(dǎo)致牙齒脫落，還可能導(dǎo)致全身性疾病的發(fā)生，如阿爾茨海默癥、心血管疾病、糖尿病等。及時(shí)診斷早期牙周病，并對(duì)其加以控制和治療，對(duì)口腔乃至全身健康具有重要的意義。本文從微流控芯片相關(guān)概念和技術(shù)出發(fā)，對(duì)該裝置在牙周病的診斷與治療中的應(yīng)用情況做一綜述，并展望其未來(lái)在牙周領(lǐng)域可能發(fā)揮重要作用的方向，為相關(guān)領(lǐng)域的研究人員提供試驗(yàn)思路與參考。
1.微流控芯片實(shí)驗(yàn)室概述
微流控芯片（microfluidics）又稱芯片實(shí)驗(yàn)室（lab-on-achip，LOC），是以分析生物和化學(xué)為研究對(duì)象，將該領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米的封裝芯片上，形成微通道網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，用以替代常規(guī)生化實(shí)驗(yàn)室各種功能的一種裝置，它的基本特征和最大優(yōu)勢(shì)是多種單元技術(shù)在微小平臺(tái)上的靈活組合和大規(guī)模集成，能夠以更高的靈敏度快速檢測(cè)分析物。
目前微流控芯片主要應(yīng)用于感染性疾病的即時(shí)檢測(cè)（point-of-care testing， POCT）、腦神經(jīng)研究、早期癌癥篩查及血管性疾病治療等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。近年來(lái)，隨著技術(shù)不斷地發(fā)展并趨于成熟，研究者將目光聚焦于微流控芯片在牙周領(lǐng)域中的應(yīng)用，并逐漸成為新的研究熱點(diǎn)，下面將逐一介紹微流控芯片在牙周病診斷與治療中的應(yīng)用前景。
2.微流控芯片與牙周病POCT診斷
即時(shí)檢測(cè)（point of care testing，POCT）是一種能在患者床旁、病房或者傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室之外的地方進(jìn)行的快速檢測(cè)分析技術(shù)，它可以在采樣現(xiàn)場(chǎng)即刻進(jìn)行分析。與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)相比，POCT在臨床檢測(cè)中具有操作簡(jiǎn)單化、標(biāo)本用量少、成本低、耗時(shí)較短等優(yōu)勢(shì)，目前已廣泛應(yīng)用于臨床治療和病情監(jiān)測(cè)。
牙周治療的首要目標(biāo)應(yīng)是早期診斷和干預(yù)。然而，目前臨床上的牙周診斷技術(shù)缺乏識(shí)別牙周病進(jìn)展高風(fēng)險(xiǎn)患者的能力，且難以監(jiān)測(cè)病變的微小轉(zhuǎn)變，因此需要開(kāi)發(fā)牙周病診斷的新方法。
近年來(lái)，研究人員在改進(jìn)原有的診斷技術(shù)及發(fā)展新技術(shù)方面進(jìn)行了大量的探索，牙周病的診斷方法正向敏感、精確、快速的方向發(fā)展，如POCT 定量檢測(cè)。相比于傳統(tǒng)的牙周探查，POCT定量檢測(cè)有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：（1）檢測(cè)樣本多為唾液，可以由醫(yī)學(xué)或非醫(yī)學(xué)人員隨時(shí)收集樣本，安全無(wú)創(chuàng)；（2）樣本量需求少；（3）多路檢測(cè)；（4）便攜、操作簡(jiǎn)單且快速；（5）成本低，可用于廣泛篩查、診斷和監(jiān)測(cè)。
由于微流控芯片微型化、集成化、自動(dòng)化的特性高度契合POCT檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展需求，采用微流控芯片進(jìn)行牙周病的POCT診斷近年來(lái)已日趨成為POCT領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
2.1 POCT芯片快速檢測(cè)牙周致病菌
以往的研究顯示某些細(xì)菌是重度牙周炎易感性的有力指標(biāo)，即病原菌在唾液中的水平可以用于評(píng)估牙周病的活動(dòng)性以及預(yù)測(cè)其進(jìn)展，因此檢測(cè)唾液中的牙周致病菌是一種潛在的牙周病診斷方式。然而，傳統(tǒng)牙周致病菌基因定量檢測(cè)主要采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction， qPCR），但該方法耗費(fèi)成本高、檢測(cè)速度慢。
為解決這些問(wèn)題，有學(xué)者嘗試將傳統(tǒng)的牙周致病菌分離鑒定技術(shù)與微流控芯片相結(jié)合以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)牙周病原菌，并通過(guò)一系列研究探索牙周病臨床診斷的新方法。目前比較公認(rèn)的牙周可疑致病菌包括牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis， P.gingivalis）、齒垢密螺旋體（Treponema denticola， T.denticola）、福賽斯坦納菌（Tannerelaforsythia， T.forsythia）等。
Li等在受試者上中切牙的牙周袋內(nèi)收集齦溝液，并基于集成的連續(xù)流聚合酶鏈反應(yīng)（continuous flow polymerase chain reaction， CF-PCR）和電泳生物芯片，制作了一種便攜式一體化微流控設(shè)備，可快速診斷齦溝液內(nèi)的牙周病原體。裝置不僅實(shí)現(xiàn)了P.gingivalis、T.denticola以及T.forsythia DNA的快速擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物的現(xiàn)場(chǎng)定量檢測(cè)，而且實(shí)現(xiàn)了樣品的自動(dòng)注射。該裝置僅用2分31秒成功擴(kuò)增T.denticola，3分43秒內(nèi)完成PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。
此外該裝置的標(biāo)本用量少，可檢測(cè)的最小細(xì)菌菌落數(shù)為125 CFU/μL。該實(shí)驗(yàn)證明了CF-PCR 微流控芯片具有應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)以診斷牙周病的潛力，促進(jìn)病原體診斷和基因研究的發(fā)展，未來(lái)有望將CF-PCR芯片轉(zhuǎn)化至臨床應(yīng)用。
2.2 POCT芯片快速檢測(cè)牙周病生物標(biāo)志物
以往研究認(rèn)為生物體液中的炎癥介質(zhì)水平是判斷牙周組織炎癥活動(dòng)的良好指標(biāo)，牙周病患者口腔中的唾液含有牙周病誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)，這表明唾液檢測(cè)具有評(píng)估牙周病患者炎癥狀況和風(fēng)險(xiǎn)以及作為牙周病診斷方式的潛力。以往檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)最可靠和常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）， 但該方法存在樣本和試劑反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、操作技術(shù)難度大以及設(shè)備昂貴等問(wèn)題。
Herr等設(shè)計(jì)并開(kāi)發(fā)了一個(gè)用于口腔診斷的集成微流控平臺(tái)（integrated microfluidic platform for oral diagnostics，IMPOD），該平臺(tái)可用于對(duì)唾液樣本進(jìn)行即時(shí)、快速的分析。此外，該研究團(tuán)隊(duì)在另一項(xiàng)研究中將唾液樣品預(yù)處理與電泳免疫分析相結(jié)合，耗時(shí)僅10 min便可測(cè)量經(jīng)最低限度預(yù)處理的唾液樣品中分析物的濃度。
MMP-8被認(rèn)為是牙周病主要的組織破壞酶，研究人員采用POCT 芯片與ELISA 法分別檢測(cè)了健康人與牙周病患者唾液中MMP-8的水平，結(jié)果顯示兩種方法測(cè)量出的MMP-8水平具有一致性，健康人的MMP-8水平顯著低于牙周病患者且牙周病患者中MMP-8的水平與牙周病破壞的程度具有線性相關(guān)性。該結(jié)果支持MMP-8可能與牙周病活動(dòng)有關(guān)，是判斷牙周病嚴(yán)重程度較理想的生化指標(biāo)。
唾液中有一種由內(nèi)皮非合成酶釋放的一氧化氮產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)——亞硝酸鹽，其濃度與牙周組織的臨床癥狀呈負(fù)相關(guān)，可以作為牙周病進(jìn)展的一個(gè)指標(biāo)。亞硝酸鹽的定量分析有許多種方法，其中分光光度法在簡(jiǎn)單性、儀器需求、成本和靈敏度之間提供了一個(gè)適當(dāng)?shù)钠胶�，雖然該方法已被廣泛使用，但缺點(diǎn)是需要分光光度計(jì)、較多的試劑及大樣本量。Bhakta等設(shè)計(jì)并制造出一種微流體紙基分析設(shè)備，該裝置可以幫助建立唾液亞硝酸鹽水平和牙周炎之間的關(guān)系。最終結(jié)果顯示微流體紙基分析設(shè)備可以準(zhǔn)確地測(cè)量出受試者唾液中亞硝酸鹽的濃度范圍并與傳統(tǒng)分光光度計(jì)測(cè)量結(jié)果呈線性關(guān)系。
3.微流控芯片與牙周病相關(guān)治療研究
牙周病的治療關(guān)鍵是控制菌斑、消除炎癥。目前的治療方法主要包括基礎(chǔ)治療、藥物治療、手術(shù)治療以及新技術(shù)應(yīng)用等。近年來(lái)，微流控芯片應(yīng)用于牙周抗菌治療，特別是對(duì)菌斑生物膜的影響研究較多。為了更好地了解生物膜的發(fā)生發(fā)展特性，Brann等設(shè)計(jì)并制造了一個(gè)微流控可視化芯片，并利用該新型成像芯片和白光干涉術(shù)（white-light interferometry，WLI）監(jiān)測(cè)齦下菌斑生物膜結(jié)構(gòu)的變化。WLI成像原理是依靠邁克爾遜式白光干涉成像系統(tǒng)的干涉物鏡能夠收集數(shù)據(jù)，用于構(gòu)建樣本表面的三維輪廓。
Brann等人的研究顯示，采用該芯片所成圖像可以展現(xiàn)菌斑生物膜在不同時(shí)間的發(fā)展情況，結(jié)果顯示菌斑生物膜的發(fā)展是從獨(dú)立的小菌斑逐漸發(fā)展、融合為大的菌斑且菌斑厚度也隨著時(shí)間的推移而增加。WLI成像有助于監(jiān)測(cè)生物膜發(fā)育的早期階段和成熟生物膜結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化。
未來(lái)，WLI和微流控芯片可能用于測(cè)試生物膜特異性治療的有效性，以對(duì)抗與生物膜形成相關(guān)的牙周疾病。Belibasakis等利用微流控芯片技術(shù)探究齦下菌斑生物膜對(duì)牙齦上皮細(xì)胞間連接相關(guān)的62個(gè)基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示齦下菌斑生物膜對(duì)緊密連接、貼壁連接和縫隙連接的表達(dá)影響有限，但對(duì)上皮細(xì)胞間橋體成分的基因表達(dá)有較大影響。該研究不僅證實(shí)了齦下菌斑生物膜可以下調(diào)牙齦上皮細(xì)胞間的橋粒連接，損害牙齦組織的結(jié)構(gòu)完整性，有利于細(xì)菌入侵和慢性感染，還證明了微流控芯片未來(lái)可以應(yīng)用于齦下菌斑生物膜模型相關(guān)的各種研究，如基因表達(dá)等。
隨著基因組計(jì)劃的快速發(fā)展，基因芯片與高通量測(cè)序技術(shù)在全基因組和轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序、疾病的基因?qū)用鏅C(jī)理探究等方面應(yīng)用廣泛，雖然新興技術(shù)拓展了樣本量檢測(cè)下限，并具有多樣性、并行性、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，但現(xiàn)有技術(shù)仍存在不足之處�；蛐酒轻槍�(duì)已知微生物設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針，并不能檢測(cè)未知微生物，且目前基因芯片采用定性半定量的快速檢測(cè)方法，對(duì)于需要定量檢測(cè)的微生物仍需借助實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)才能實(shí)現(xiàn)；高通量測(cè)序技術(shù)在測(cè)序覆蓋度、均一性、可重復(fù)性、精確性等方面存在一定的缺陷，同時(shí)還存在成本昂貴、運(yùn)行時(shí)間較長(zhǎng)等問(wèn)題。
相比于前述方法，微流控芯片集成度高、準(zhǔn)確度好、試劑消耗低、反應(yīng)速度快，目前已有相關(guān)研究通過(guò)微流控裝置進(jìn)行人牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞的單細(xì)胞RNA 測(cè)序分析、評(píng)價(jià)腫瘤藥物療效、轉(zhuǎn)染mRNA、高通量篩選、檢測(cè)多種腫瘤生物標(biāo)志物以及基因的表達(dá)情況等。未來(lái)微流控芯片有望通過(guò)與單細(xì)胞測(cè)序等新興技術(shù)聯(lián)合，代替?zhèn)鹘y(tǒng)生物實(shí)驗(yàn)室操作，幫助科研人員更簡(jiǎn)便更準(zhǔn)確地完成試驗(yàn)。
4.展望
微流控芯片由于其集成度高、準(zhǔn)確度好、試劑消耗低、反應(yīng)速度快等優(yōu)勢(shì)，成為構(gòu)建多種疾病預(yù)防、診斷及治療系統(tǒng)的核心裝置。它不僅可以同時(shí)檢測(cè)并分析唾液中的多種生物標(biāo)志物，還提高了測(cè)試的靈敏度和特異性，有望推向臨床，成為正式的牙周病診斷新方法。此外，微流控芯片快速集成的優(yōu)勢(shì)有望幫助其取代傳統(tǒng)的生化試驗(yàn)室，成為基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)的新模式，同時(shí)隨著微加工技術(shù)的迅速發(fā)展，其有望提供一體化的復(fù)雜檢測(cè)和診斷功能。
當(dāng)前，各種技術(shù)，發(fā)展迅速，人工智能為口腔生物標(biāo)志物識(shí)別技術(shù)提供了新的思路。然而，微流控芯片在牙周病防治方面的應(yīng)用研究仍然不夠深入與全面，需要研究者對(duì)此進(jìn)行深入探索與研究。未來(lái)，隨著芯片技術(shù)的發(fā)展和檢測(cè)手段的提高，微流控芯片在牙周疾病領(lǐng)域應(yīng)用的深度和廣度上將會(huì)有更大的提高，有望覆蓋口腔乃至醫(yī)療行業(yè)的各個(gè)領(lǐng)域。
